Integración productiva desde lo hiper-diminuto hasta los procesos bioindustriales: la ingeniería bioquímica en acción

Laura A. Palomares, Vanessa Hernández, Martha A. Contreras, A. Ruth Pastor y Octavio Tonatiuh Ramírez Reivich

Palabras clave: nanotecnología, bioprocesos, biorreactores, VPL, glicobiotecnología

Nuestro grupo de investigación trabaja en el campo de la Ingeniería Bioquímica para integrar diferentes bioprocesos a fin de producir moléculas de origen biotecnológico, para aprovecharse principalmente en aplicaciones médico-farmacéuticas. La Ingeniería Bioquímica aplica principios biológicos, físicos y químicos para generar bienes y servicios a través del procesamiento de materiales derivados de microorganismos, células animales o vegetales y/o de sus componentes macromoleculares.

Para hacer todo lo anterior requerimos de bioprocesos; cada uno está constituido por un conjunto de procedimientos específicos —que en ingenierías llamamos ‘operaciones unitarias’— y que se realizan de forma secuencial (en serie) o en paralelo (al mismo tiempo). A lo largo del bioproceso se van transformando materias primas relativamente sencillas (como azúcares, aminoácidos y sales minerales) en (bio)productos complejos que hay que separar para múltiples aplicaciones, principalmente, en la recuperación y cuidado de la salud, así como en mejoras en la nutrición, la remediación ambiental y el desarrollo de fuentes de energía renovable y materiales novedosos.

Entender y diseñar bioprocesos, paso a paso

En prácticas de laboratorio en el bachillerato o algunas carreras universitarias, nos han mostrado operaciones unitarias, tales como destilación, filtración, mezclado, evaporación, centrifugación, etc., que podemos imaginar como bloques separados de algún proceso biológico, físico y/o químico, con los que se transforman los materiales a través de intercambios de masa, calor y/o cantidad de movimiento.

En conjunto, tales bloques conforman una especie de ’caja de herramientas’ sofisticada y variada, que las y los expertos en ingeniería bioquímica tienen a su disposición. Su reto es integrarlas de forma eficiente y sustentable a través de un entendimiento cuantitativo para generar productos al menor costo, con la mayor calidad y en cantidades suficientes para beneficio de la sociedad.

Para esto, la ingeniería bioquímica moderna aprovecha y combina conocimientos en biología molecular y las disciplinas "ómicas", matemáticas, física, bioquímica, economía, microbiología, sistemas computacionales, regulación y normatividad, y muchos otros campos más. Para quien tenga interés en una comprensión más detallada de la diversidad y amplitud de la Ingeniería Bioquímica e Ingeniería de Bioprocesos recomendamos las publicaciones al final del artículo [1,2].

Los inicios de un grupo con metas ambiciosas y viables

Nuestro grupo de investigación se fundó hacia mediados de 1990, cuando uno de nosotros, Tonatiuh Ramírez, se integró al Instituto de Biotecnología invitado por los Dres. Rodolfo Quintero y Enrique Galindo, para sumarse al entonces Departamento de Bioingeniería. El propósito fundamental de nuestro grupo en aquel momento era iniciar una línea novedosa en la investigación y desarrollo de México, enfocándose en el cultivo de células animales para la producción de 1) anticuerpos monoclonales: que son proteínas que reconocen de forma específica y única a un antígeno; así como, 2) glicoproteínas recombinantes: que al igual que los anticuerpos monoclonales, se producen cultivando células genéticamente modificadas en equipos para síntesis biotecnológica (biorreactores) y que consisten en proteínas "decoradas" con cadenas ramificadas de glicanos o azúcares.

Iniciamos en México la aplicación de métodos computacionales modernos para el control de biorreactores con base en variables fisiológicas fundamentales [3, 4]. Después, Laura Palomares se integró al grupo en 1993; primero como estudiante de posgrado y posteriormente como investigadora. Ella ha aportado renovadas ideas y conocimientos en glicobiotecnología y expresión de proteínas recombinantes a través del sistema células de insecto-baculovirus [5, 6]. Este sistema consiste en infectar células de insecto con un virus (baculovirus) que contiene los genes para producir la proteína recombinante de interés. Con esto iniciamos una línea de investigación denominada virotecnología [5, 6].

Más temas de estudio alrededor de los bioprocesos

El interés en el cultivo de células animales (células de eucariontes superiores, principalmente de mamíferos e insectos) radica en su capacidad para secretar al medio de cultivo proteínas recombinantes complejas en su forma "natural" o nativa; es decir completas y plegadas adecuadamente [Fig. 1]. Tales proteínas son similares a las humanas ya que, entre otras características, poseen modificaciones que ni bacterias ni células de eucariontes inferiores pueden realizar. Estas modificaciones, que se llaman postraduccionales, se adquieren después de que se ensamblan las cadenas de aminoácidos por la maquinaria celular.

El mejor ejemplo de estas modificaciones postraduccionales es la N-glicosilación, que consiste en la adición de cadenas de azúcares (oligosacáridos) en algunas asparaginas que están en secuencias particulares de las cadenas polipeptídicas. En aplicaciones farmacéuticas, la estructura y modificaciones postraduccionales de una proteína determinan sus propiedades fundamentales, como solubilidad, inmunogenicidad, tiempo de residencia en el torrente sanguíneo y finalmente actividad biológica. De ahí que muchas proteínas usadas como biomedicamentos o vacunas requieren ser producidas por cultivos de células animales.

A pesar de la relevancia de las células animales, sus cultivos representan retos ingenieriles notables ya que por ejemplo son células muy delicadas cuando están bajo la turbulencia que existe en un biorreactor; en bioingeniería decimos “son extremadamente frágiles a los esfuerzos de corte”. Esto impone problemas para el correcto intercambio de gases (oxígeno y dióxido de carbono) y el crecimiento y, por ende, a la hora de querer llevarlo a mayores volúmenes; es decir, hacer el escalamiento.

Asimismo, hay otras consideraciones: este tipo de cultivos celulares requieren nutrimentos complejos y caros (p.ej. el suero fetal bovino); resultan muy susceptibles a varios subproductos tóxicos del metabolismo (p. ej. ácido láctico y amonio); crecen muy lento y se alcanzan concentraciones muy bajas de células y productos. De ahí que la productividad, cuando se compara con las fermentaciones bacterianas, sea baja. Sin embargo, desde los tiempos en que nuestro grupo inició su trabajo, hasta hoy, se ha logrado aumentar tres órdenes de magnitud (cerca de mil veces), las concentraciones de producto gracias a los aportes de la ingeniería de bioprocesos, lo que hace más accesibles estos productos a la población en general.

¿Cuáles son nuestras moléculas de batalla?

Entre las glicoproteínas que trabajamos en nuestro grupo, están los anticuerpos monoclonales y algunos factores de crecimiento (proteínas que estimulan la proliferación de ciertas células y tejidos); también hay antígenos que pueden usarse para generar vacunas, así como hormonas y enzimas de varios tipos; la mayoría poseen gran valor como biomedicamentos para tratar graves padecimientos, tales como cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos secretados por clonas, es decir proceden de una misma célula originaria y poseen una alta afinidad y gran especificidad contra un antígeno particular. Por estas características son muy útiles, por ejemplo, en el diagnóstico clínico y como “balas de plata" que funcionan para "acarrear” moléculas que se pueden unir a ellos y ser dirigidos hacia un tipo especial de célula (p. ej., células cancerosas).

Algunas otras de las proteínas que estudiamos constituyen unidades básicas (llamadas capsómeros) que se autoensamblan produciendo partículas pseudovirales (VLP por sus siglas en inglés). Como pueden observar en la figura 1-C y 1-D, las VLPs son complejos proteicos multiméricos (es decir, estructuras compuestas por decenas o centenas de capsómeros acopladas de forma organizada) que asemejan a un virus pero que carecen de material genético (Fig. 1). Es decir, las VLP son cápsides virales vacías por lo que no presentan riesgo (no son patogénicas), pero son ideales para emplearlas como vacunas o como extraordinarios vehículos moleculares especializados para terapia génica o entrega de fármacos a tejidos específicos [7]. Todas estas aplicaciones son tema de estudio en nuestro grupo.

También empleamos las VLPs como ‘andamios’ para construir nanobiomateriales, que son estructuras del tamaño de apenas una milmillonésima de metro (nanómetro, ver escalas comparativas en Biotecmov 25 (3): 13-19) con aplicaciones en campos que van más allá del médico-farmacéutico [8]. Por ejemplo, usamos VLP de virus diversos para recubrirlas o rellenarlas de diversos metales y generar novedosos nanomateriales con propiedades ópticas, eléctricas y mecánicas únicas. De tal forma que, partiendo de proteínas complejas, producimos ensambles multiméricos más complejos, que usamos a su vez para fabricar nanobiomateriales aún más complicados.

¿Con qué tipo de sistemas biotecnológicos generamos estos materiales?

Para producir las moléculas arriba descritas empleamos principalmente células de ovario de hámster chino, que por sus siglas en inglés llamamos CHO, y que "expresan" (esto es, producen, sintetizan) proteínas recombinantes cuando las modificamos genéticamente. Con estas células podemos producir proteínas cuyas modificaciones postraduccionales son muy similares a las humanas. El otro sistema, que ya comentamos, es el sistema de expresión células de insecto-baculovirus. Para otros proyectos también trabajamos extensamente con bacterias como Escherichia coli, levaduras como Pichia pastoris, y otros procariontes y células de eucariontes de especies más simples. En estos últimos modelos, con los que es más fácil trabajar, producimos proteínas recombinantes más sencillas sin muchas de las modificaciones postraduccionales complejas referidas anterioremente. Es decir, que después que las proteínas en cuestión son sintetizadas (que en términos científicos es la ‘traducción’) no requieren reaccionar con otras especies químicas ni necesitan cambios adicionales en su estructura tridimensional, para ser funcionales.

Como hemos relatado aquí, aprovechamos una gran variedad de modelos biológicos para estudiar temas de ingeniería de bioprocesos, como lo es el escalamiento ascendente y descendente. El primero consiste en establecer las mejores condiciones para trasladar un proceso desde una escala pequeña de laboratorio a los grandes volúmenes que se requieren en la escala industrial sin perder productividad. El segundo caso consiste en simular en pequeña escala (p. ej. en menos de 2 Lt) las heterogeneidades ambientales que son inherentes en la operación de biorreactores comerciales de gran escala (mayores a las decenas de miles e inclusive centenas de miles de Lt), pero en los que es imposible o poco práctico experimentar [9].

En los biorreactores no hay, en todo momento, una distribución homogénea de sus condiciones físicas o bioquímicas óptimas y se generan gradientes o heterogeneidades. Entre las heterogeneidades que estudiamos se encuentran gradientes de oxígeno disuelto, dióxido de carbono disuelto, concentración de glucosa, la temperatura del medio y los mencionados "esfuerzos de corte" (causados por la agitación, el burbujeo o el flujo a través de tuberías y diversos dispositivos del proceso), por mencionar algunos. En los estudios de escalamiento descendente empleamos biorreactores con diferentes configuraciones (por ejemplo, de tipo tubular) o los llamados ‘quimiostatos agitados’ que se disponen en sistemas modelo conformados de uno o varios compartimientos. Los resultados los empleamos como herramienta fundamental para desarrollar estrategias racionales de escalamiento e integración de bioprocesos, que es otro de los grandes temas de trabajo del grupo.

De la mano con lo anterior, abordamos otras líneas fundamentales como el monitoreo, control y diseño de biorreactores y estudios de la fisiología y metabolismo celular. En este último caso, abordamos investigaciones en ingeniería de vías metabólicas (IVM, ver BiotecMov 29.1) para generar células hospederas —células que son modificadas genéticamente para fabricar las proteínas o metabolitos de interés— que puedan contender más eficientemente con las condiciones adversas y limitaciones que enfrentarán en un bioproceso típico.

Las otras grandes líneas de investigación de nuestro grupo versan sobre la ingeniería de rutas de N-glicosilación que, como mencionamos ocurre con la adición de cadenas cortas o ramificadas de azúcares que se unen a ciertos sitios de las proteínas, así como aspectos de glicobiología. Además, estudiamos el proceso de ensamblaje de sistemas proteicos multiméricos para producir VLP y nanobiomateriales complejos [Fig. 1].

Más allá de la academia: un par de ‘brazos’ adicionales

Ya que somos un grupo con una orientación ingenieril, nuestra motivación central es resolver problemas relevantes que beneficien a la sociedad. Filosóficamente esto contrasta con un grupo de investigación básica, cuyo interés radica en plantear preguntas fundamentales sobre los fenómenos de estudio. Consecuentemente, como grupo cercano a las aplicaciones prácticas, hemos desarrollado dos ‘brazos’ adicionales al puramente académico y de formación de recursos humanos altamente especializados: uno para la vinculación y desarrollo tecnológico y otro para brindar servicios técnico-científicos.

En cuanto al primer brazo, a lo largo de las últimas tres décadas nos hemos caracterizado por vincularnos estrechamente con el sector productivo y el sector gubernamental. Así, hemos establecido relaciones muy exitosas con más de una treintena de empresas privadas e instituciones públicas, con las cuales nos hemos vinculado. Las colaboraciones abarcan todo el espectro posible, desde aspectos relativamente sencillos como capacitación de personal y asesorías técnicas puntuales, hasta el desarrollo completo y transferencia de tecnologías que han llegado a su implementación comercial. Sería difícil describir aquí lo logrado a través de este ‘brazo’ pero resaltaremos algunos de los casos más exitosos donde hemos demostrado que se pueden cerrar ciclos virtuosos para convertir conocimiento, a través de la innovación, en beneficios sociales. Entre ellos destacan nuestras colaboraciones, actuales y pasadas, como por ejemplo con Jaime Uribe de la Mora y Jaime Uribe Weichers de Probiomed; Manon Cox y Dan Adams de Protein Sciences, Alfredo Rimoch y Sergio Valentinotti de Liomont, y Carlos González de Boehringer-Ingelheim; entre muchas otras mantenidas a lo largo de los años.

El esfuerzo del ‘brazo’ de servicios tecnológicos y analíticos que iniciamos hace varias décadas, culminó con el establecimiento del "Laboratorio Nacional para la Producción de Moléculas y Medicamentos Biotecnológicos" (LAMMB, situado en el IBt en Cuernavaca), cuyo propósito fundamental es facilitar la entrada de más actores relacionados para que puedan incursionar y competir exitosamente en el campo de la biotecnología médico-farmacéutica. El LAMMB aporta capacidades y conocimientos que no se ofrecían antes en el país y por ende limitaban el desarrollo nacional del campo biofarmacéutico. Este esfuerzo ha sido coronado recientemente por un hecho único, que es el otorgamiento de la Licencia Sanitaria por parte de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios (Cofepris), que es la autoridad mexicana en la materia.

Finalmente, hemos emprendido un proyecto, aún más ambicioso, consistente en instalar una planta piloto en Pachuca, en el Estado de Hidalgo, la cual operará bajo los estándares de "Buenas Prácticas de Fabricación" y que servirá, no solamente para capacitar personal en un entorno de manufactura real, sino que además producirá dosis de vacunas y biomedicamentos experimentales que se emplearán para su evaluación en pruebas clínicas (ver [BiotecMov 28.2 ]). Esta iniciativa pretende mostrar que en México podemos cerrar círculos virtuosos a través de la vinculación academia-industria-gobierno.

Referencias:

1. Ramírez OT (2003). “Nuevos Bioprocesos", en: Fronteras de la Biología en los Inicios del Siglo XXI/ Ingeniería Celular: Biodiversidad e Industria, (F. Bolívar y A. López-Munguía, eds.), pp. 93-121. México: El Colegio Nacional. ISBN 970-640-208-X.
2. Ramírez OT (2004). “Ingeniería Bioquímica", en: Fundamentos y Casos Exitosos de la Biotecnología Moderna, (F Bolívar, ed.), pp. 249-297. México: El Colegio Nacional. ISBN 970-640-235-7.
3. Palomares LA, NA Valdez y OT Ramírez. (2008). “Superando los retos del cultivo de células animales a través de la bioingeniería”, en: Una Ventana al Quehacer Científico: Instituto de Biotecnología 25 aniversario, (F. Rebolledo y A. López Munguía, comp.), pp. 385-398. Cuernavaca, Mor. México: Dirección General de Divulgación de la Ciencia/ IBt-UNAM. ISBN 978-970-32-4658-8.
4. Palomares LA, S Estrada-Mondaca, & OT Ramírez (2004). “Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions" In: Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols, (P Balbás & A Lorence, eds.), pp. 15-51. Methods in Molecular Biology book series, vol. 267, 2nd ed., Totowa NJ (USA): Humana Press. ISBN 1-58829-262-2. DOI:10.1385/1-59259-774-2:015
5. Palomares LA y OT Ramírez. (2007). “Glicosilación de proteínas recombinantes: Importancia y relación con las condiciones de bioproceso”, en: Diseño y Producción de Fármacos (E Juaristi, coord.), pp. 23-123. Ciudad de México: El Colegio de México. ISBN 978-970-640-356-8.
6. Palomares, IK Srivastava, OT Ramírez & MMJ Cox (2018). “Glycobiotechnology of the Insect Cell-Baculovirus Expression System Technology” In: Advances in Glycobiotechnology, (E Rapp, U Reichl, eds.) pp. 71-92, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology book series. Springer, Cham. DOI:10.1007/10201861
7. Villanueva-Flores F, A Castro-Lugo, OT Ramírez, & LA Palomares (2020). Understanding cellular interactions with nanomaterials: Towards a rational design of medical nanodevices Nanotechnol 31: 132002. DOI:10.1088/1361-6528/ab5bc8
8. Plascencia-Villa G, LA Palomares y OT Ramírez. (2011). Síntesis y ensamblaje de nanomateriales usando proteínas virales como templados. BioTecnología (SMBB) 15: 3 (50-77).
9. Palomares LA & OT Ramírez (2000). “Bioreactor Scale-Down” In: Encyclopedia of Cell Technology, Vol. 1, pp. 174-183 (RE Spier, ed). John Wiley & Sons. ISBN 0-471-16643-x. DOI:10.1002/0471250570.spi022.